Práctica 3 – 2025

Objetivo

En esta práctica vamos a analizar datos de secuenciación masiva de RNAs pequeños (miRNA-seq).

Usaremos este experimento:  SRP544098 del repositorio público SRA. De este experimento se asigna al menos una muestra a cada estudiante.

ID SRX
1 SRR31290390
2 SRR33614430
3 SRR31290385
6 SRR33614429
8 SRR31290381
11 SRR33614414
12 SRR33614415

A. Referencias de miRNAs

Para el análisis de miRNA-seq necesitamos una base de datos curada con las secuencias y anotaciones de miRNAs.
La referencia estándar es miRBase, que contiene para cada microRNA:

  • su secuencia madura (miRNA-5p y miRNA-3p),

  • su precursor (“hairpin”),

  • su localización genómica,

  • la especie a la que pertenece,

  • información funcional y bibliográfica.

B. Repositorios públicos

Los repositorios como SRA (Sequence Read Archive) y GEO (Gene Expression Omnibus) contienen miles de datasets generados por laboratorios de todo el mundo. Su utilidad es enorme: permiten validar hipótesis, reutilizar datos, y aprender metodologías reproducibles sin necesidad de realizar experimentos de laboratorio.

1. Descarga de datos desde SRA

Para descargar los archivos FASTQ desde el SRA utilizaremos el toolkit oficial:

fastq-dump --gzip SRR31290390

2. Eliminar el adaptador

Existen muchos protocolos para la preparación de la librería cDNA, y en cada uno se usa un adaptador diferente. Parte de los adaptadores se secuencian (si la molécula es más corta que el número de ciclos) y por ello tenemos que detectar primero estas secuencias y eliminarlas de las lecturas.

Entre los mas usados se encuentran:

  • TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
  • TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
  • AGATCGGAAG

sRNAbench input=/home/cris/tema7/SRR31290390.fastq.gz output=/home/cris/tema7/mirna/SRR31290390 adapter=AGATCGGAAGAGCACACGT remove3pBases=5 removeBarcode=5

¿En qué nos fijamos?

  • En la carpeta de salida tenemos el fichero results.txt, donde podemos ver el porcentaje de lecturas para las que se detectó el adaptdor
  • El fichero reads_orig.fa: Contiene los reads a los que se les ha quitado el adaptador

3. Cuantificación de miRNAs con sRNAbench

sRNAbench es una herramienta específica para miRNA-seq que:

  • detecta adaptadores,

  • colapsa lecturas idénticas,

  • mapea contra precursores y secuencias maduras,

  • cuantifica expresión,

  • analiza isomiRs y diversas variantes.

Ejemplo:

sRNAbench input=/home/cris/tema7/SRR31290390.fastq.gz output=/home/cris/tema7/mirna/SRR31290390 adapter=AGATCGGAAGAGCACACGT remove3pBases=5 removeBarcode=5 microRNA=hsa

microRNA=hsa indica que se usen los microRNAs de humanos; mmu seria para el ratón o rno para la rata, bta para la vaca (Bos Taurus) etc.

¿En qué nos fijamos?

  • Porcentaje de lecturas mapeadas a miRNAs. Cuanto mayor es, mejor.
  • Proporción de lecturas que alinean frente a otros RNAs (tRNA, rRNA, snoRNA,…), muy útil para detectar contaminación.
  • Distribución de isomiRs -> Modificaciones de los miRNAs.

Archivos importantes:

  • El fichero mature_sense.grouped
  • la carpeta hairpin

4. Calcular la expresión diferencial

SRR31290390:SRR31290385:SRR31290381

SRR33614430:SRR33614429:SRR33614414:SRR33614415

sRNAde input=/home/cris/tema7/mirna output=/home/cris/tema7/results/matrix grpString=SRR31290390:SRR31290385:SRR31290381#SRR33614430:SRR33614429:SRR33614414:SRR33614415 grpDesc=disease#healthy diffExpr=true

fichero para generar el string de grupos

¿En que nos fijamos?

  • La matrix de expresión: mature_sense_minExpr1_RCadj_libraryRPM.mat

5. Normalizar el conteo

Antes de comparar perfiles de expresión entre muestras, es imprescindible normalizar los datos. La normalización corrige diferencias en profundidad de secuenciación y en composición global entre bibliotecas.

Métodos comunes de normalización incluyen:

  • RPM (Reads Per Million): ajusta por el número total de lecturas mapeadas.

  • TMM (Trimmed Mean of M-values): corrige diferencias de composición entre muestras.

  • DESeq2 size factors: ajusta la distribución global de los conteos.

En sRNAde ya se generan matrices normalizadas, pero es importante entender el razonamiento:

Objetivo de la normalización
Garantizar que una diferencia observada en expresión refleja cambios biológicos y no variaciones técnicas.

6. Análisis exploratorio: heatmap

El análisis exploratorio permite evaluar la calidad de las muestras antes de proceder con análisis más avanzados.

Un heatmap de las expresiones normalizadas permite visualizar:

  • similitud global entre perfiles de expresión,

  • agrupamientos (clústeres) esperados entre condiciones,

  • posibles outliers, como muestras contaminadas o procesadas incorrectamente.

También se suelen visualizar:

  • diagramas PCA/UMAP para ver agrupamientos globales,

  • correlaciones entre muestras (Pearson o Spearman).

¿Qué debemos evaluar en el heatmap?

  • Que las muestras del mismo grupo formen clústeres.

  • Que no existan muestras aisladas con patrones completamente distintos.

7. Determinar la expresión diferencial

Para determinar la expresión diferencial tenemos que:

  • normalizar el conteo para poder comparar diferentes muestras
  • calcular la magnitud de cambio (fold-change) para cada microRNA como: log2 (media de expresión (casos) / media de expresión (controles)
  • calcular la significación estadística para el FC mediante un test de student
  • corregir el valor p (multiple testing, comparaciones múltiples)
  • extraer los microRNAs que se sobre-expresan y los que se infra-expresan

Una vez validada la calidad, podemos identificar qué microRNAs cambian su expresión entre condiciones.

Para determinar la expresión diferencial tenemos que:

    1. Normalizar los conteos (RPM / TMM / DESeq2 size factors)

    2. Calcular el cambio de expresión:

      Para cada miRNA: log2 (media de expresión (casos) / media de expresión (controles)

    3. Evaluar la significación estadística:

      1. Test de Student (en sRNAde)

      2. Alternativas comunes: Wald test (DESeq2), LRT, Wilcoxon.

    4. Corregir el valor p (multiple testing, comparaciones multiples):
      • https://en.wikipedia.org/wiki/False_discovery_rate#Benjamini.E2.80.93Hochberg_procedure
      • https://en.wikipedia.org/wiki/Bonferroni_correction
    5. Seleccionar los miRNA diferencialmente expresados:
      • Sobre-expresados: log2FC > 0 y FDR significativo
      • Infra-expresados: log2FC < 0 y FDR significativo

Archivos clave

  • mature_sense_minExpr1_RCadj_libraryRPM.mat → matriz normalizada para análisis.

8. Explorar los microRNAs mediante TarBase

9. Analizar los microRNAs mediante miRPath

miRPath_v4

mirTarget

miRPath permite detectar las rutas KEGG que contienen mas genes regulados por ciertos microRNAs que se esperaría por azar

Rutas en el cáncer  –> pathway entry:  532 genes

Homo sapiens en KEGG:     20364 genes codificantes (19178 genes no codificantes)

Pregunta: ¿Cuál es la probabilidad de obtener 20 genes codificantes que actúan en ‘Rutas del cáncer’ en una lista aleatoria de genes con tamaño 200?

Cuestiones:

  • ¿Que muestra habría que eliminar del análisis y por que?
  • ¿Cuantos microRNAs se expresan diferencialmente entre individuos sanos y individuos con cáncer?
  • ¿Que microRNAs podrían estar causalmente implicados en la formación del tumor?